缪 云 根
(浙江农业大学蚕学系 310029)
家蚕幼虫消化液红色萤光蛋白质的研究始于60年代后期。随着人工饲料育研究的开展,自然就有必要比较探讨这两种不同方法饲育蚕的病理学及生理生化学差异,发现了人工饲料育蚕对病毒病(主要是核多角体病)抵抗力要远远小于桑叶育蚕,进一步研究表明这种抵抗力的差异除了体质方面的原因外,更重要的是由于家蚕消化液使病毒失活能力的差异,这种差异很大程度上取决于幼虫消化液中红色萤光蛋白质,也就是说在桑叶育情况下,蚕消化液中存在着红色萤光蛋白质,它具有使家蚕核多角体病毒失活的能力;而在完全人工饲育或准人工饲料育时,蚕消化液中则分离不到这种红色萤光蛋白。在明确这一点的基础上,通过改进人工饲料配方,使之产生红光萤光蛋白,大大增强了人工饲料育蚕对病毒病的抵抗性。
一、红色萤光性物质的分离


二、红色萤光蛋白的病毒灭活作用
将病毒稀释液加入10倍量的消化液或PH缓冲液,25℃下体外处理1小时后,8000rpm离心20分钟,取0.001ml上清液直接注射接种家蚕幼虫,调查其病毒的感染率。处理设区为:
A;人工饲料育蚕消化液
B:桑叶育蚕消化液
C:PH9.6缓冲液十红色萤光分段(1.2活性单位)
D:PH9.6缓冲液十红色萤光分段(6.0活性单位)
E:人工饲育消化液红色荧光分段(6.0活性单位)
试验结果见表1。
试验结果表明了红色萤光蛋白具有病毒灭活作用;人工饲料育蚕消化液中缺乏这一红色
萤光物质,或其分泌量很少。
三、红色萤光蛋白的产生部位
设计三个区,即桑叶育,人工饲料育及添加叶绿体的人工饲料育,于五龄第3日取出消化管,用生理盐水仔细洗涤中肠部分,在紫外线下肉眼观察荧光的有无。
在可见光下,桑叶育蚕中肠的部分呈青绿色,后部为白绿色。紫外线下观察,前、后部界线清楚,即上述青绿色部分发出红色荧光。人工饲育蚕的中肠全体呈白黄色,前部的青绿色部分不明显,紫外线下也观察不到红色荧光。而深加叶绿体的人工饲料育蚕中肠前后部区别明显,前部呈现浓绿色,紫外线下红色荧光非常强。在这一观察中,由于是切取中肠组织的一部分,并且经生理盐水充分洗涤,已除去消化液。所以认为发出红色荧光的物质存在于中肠组织内,红色荧光蛋白质是由中肠前部所分泌的。
四、红色荧江蛋白质(RFP)的合成机制
早期的研究认为,红色荧光蛋白的生成是由丙酮可溶性叶绿体部分(S1)和不溶性部分(P1)及中肠磨碎在37℃,PH10.4下经2.5小时反应。即
 进一步对各部分物质的分离工作有了突破性的进展。将SI部分以石油醚为展开液,用蔗糖柱层析法进行反复数次层析,最后得到纯化的物质,其吸收峰在428.5 smu及660.5mu,从而推测SI中的有效成份为叶绿素a。
将PI部分以稀释盐酸抽提,然后进行多次柱层析。透析、悬浮等得到较为纯化的活性成分,这个活性物质在275mu处有最大吸收峰,推测是一种蛋白质。根据可以用稀盐酸抽提及在电泳中的移动认为是碱性蛋白质。现将叶绿体部分的分离工作总结如下:
的活性蛋白
通过以上工作分别得到了合成红色萤光蛋白的有效成分,那么这些成分的反应顺序如何,曾设计了以下实验。设:
A:中肠磨碎液
B:丙酮可溶性叶绿体部分
C:丙丽不可溶性叶绿体部分
根据其反应顺序与红色荧光强度的关系其反应顺序模式为:
五、红色荧光蛋白生成步骤
六、总结
根据以上研究。桑叶育蚕对病毒(尤其是核型多角体病毒)病的抵抗力高于人工饲料育蚕,其重要原因之一是桑叶育蚕的中肠腔内存在有红色萤光蛋白质。因此为增强人工饲料育蚕对病毒病的抵抗力,应根据其红色萤光蛋白的合成机制,一方面可改进饲料配方;另一方面实行明饲育,尤其是大蚕期的明饲育。
关于红色萤光蛋白的病毒灭活作用,推测这是一类色素蛋白,能产生光增感反应。向井等在体外试验结果表明:如将红色萤光蛋白与氨基酸、核酸混合,光照射条件下明显地引起光增感效应,并引起氨基酸、核酸的氧化,发挥红色荧光蛋白的机能。
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