生物技术给蚕丝业带来了曙光


陈克平
(中国农业科学院蚕业研究所212018)


  古老的蚕丝业在漫长的人类生涯中,经过了千疮百孔的岁月,走过了坎坷不平的道路。在传统的农业生产中独树一帜,为美化人类生活作出了不可磨灭的贡献。然而,当历史的车轮驶进20世纪后期,蚕丝业如何摆脱传统的生产方式,如何进一步挖掘生产潜能、另劈新径,以迎接21世纪生物新技术的挑战,这是蚕业科技工作者所面临的新问题和肩负的历史重任。本文将以生物技术为线索,回顾蚕丝业研究的新成果,尤其是“国际蚕分子育种计划”后的新成绩,瞻望这一计划的前景,这对于我们抓住机遇,接受挑战是很有必要的。
  l 基因工程理论上三大发现和技术上三大发明,揭开了生物技术的新篇章
  Avery 1934年在美国的第一次学术会议上首次报道了肺炎球菌(Diprococcus Pneumonas)的转化,不仅证明了DNA是生物遗传物质,而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌,这是一个超越时代的科学成就。正如诺贝尔奖金获得者Lederbevg指出的,Avery的工作是现代生物科学的革命开端,也可以说是基因工程的先导; 1953年 Watson和 Crick吸收了前人的经验,以超凡的科学思维方法提出了DNA的双螺旋模型;1961年Monod和Jacob提出了操纵子学说,以Nireberg等为首的科学家确定了遗传信息是以密码方式传递的,1966年全部破译了64个密码子,编排一本密码字典,提出了中心法则。阐明了遗传信息流是DNA-RNA一蛋白质。从此,千百年来神秘的遗传现象,从分子水平上得到了揭示。
  1970年,Smith和 Wilcox在流感嗜血杆菌(Haemophilius influenzae)中,发现了限制性核酸内切酶 HindⅡ, 1972年 Boyer又发现了EcoRⅠ,从而能够切割DNA而获得特殊的
片段,为基因工程提供了技术基础;1967年世界上五大实验室几乎同时发现DNA连接酶。
这种酶能够参与DNA裂口的修复,使DNA体外重组又更上一层楼。1946年Lederberg开始研究细菌的性因子(F因子),其后相继发现其它质粒,如R因子、CoE因子。到1973年Cohen首先将质粒作为基因工程载体使用,这是基因工程诞生的第二次技术发明;1970年Balitimore和Temin等人发现了逆转录酶,修改了中心法则。从此,基因工程理论和技术日臻成熟。
  1972年美国的斯坦福大学P.Berg领导的研究小组在世界上第一次成功地实现了猿猴病毒SV40和人的DNA体外重组而获得杂种DNA分子。1973年S.Cohen等人将大肠杆菌(E.Cole)的抗四环素(TC1)PSC101和抗新霉素(Nel)及抗黄腹(SI)的质粒R6-3,
在体外用限制性内切酶EcoRⅠ切割,连接成新的重组体,在大肠杆菌中表达,获得了TC1Ne1重组菌落,实现了遗传工程史上第一个重组转化。1977年Itakura等人用人工合成的生长激素释放抑制素(somatostadn,SMT)基因,第一次实现了真核基因在原核细胞中的表达,轰动了全世界。他们用价值几美元的9升溶液生产出50mg的生物活性物质,相当于50万头羊脑的提取量。1978年Goeddel等人用化学会成的胰岛素基因在大肠杆菌中表达成功。日本科技人员使大豆蛋白基因插入大肠杆菌质粒中人工合成大豆蛋白获得成功。1981年,从遗传工程菌获得的产物有动物的口蹄疫疫苗,乙型肝炎病毒表面抗原以及牛生长激素等。1982年英、美等国以真核生物为受体的遗传工程也有了新的突破,最重要的工作有两项:一是使包括各种抗药基因,酵母的乙醇脱氢酶基因和菜豆的贮存蛋白基因在植物细胞中的表达;二是利用类似于巨型小鼠的遗传操作法,把人的生长激素基因转移给小鼠获得了巨型鼠。此外,美国和英国正在实施培育超级猪,超级羊以及降解原油的超级菌。1987年报道美国科学家将萤光虫的荧光素基因转入烟草植物细胞,获得高水平的表达。生长的植物通体发亮,堪称自然界奇观。美国 Monsanto.COM,已将苏云金杆菌的δ-内毒素基因通过Ti质粒整合到番茄染色体中,获得了具有抗虫能力番茄植株。日本利用基因重组技术培育出抗稻枯病水稻品种,基因重组研制出的“凝乳酶”,经过严格的食品法审查后已上市。美国食品与药物管理局 95年 7月最终确认Ciba seeds公司重组耐虫性玉米的安全性、给予销售。因此,12种重组农作物在美国得到认可。
  我国在国家863高新技术的支持下,主要开展了高产优质抗逆动植物新品种、新型疫苗药物和基因治疗、蛋白质工程等方面的研究。在跟踪世界生物技术前沿的基础上,逐步形成了我国生物技术体系。首创了两系杂交水稻;独立人工合成构建的苏云金芽抱杆菌晶体蛋白(Bt)基因,已成功地转入棉花,获得抗虫能力的棉花品系;生物固氮;试管牛羊。基因治疗和蛋白质工程研究也达到了国际先进水平,已有五种基因工程疫苗获准投放市场。
  2 生物新技术向传统的蚕丝业提出挑 战蚕丝业正乳育着一场新技术革命 
  正当人们为继承传统的蚕丝业,在这块密集型土地上辛勤耕耘时,生物新技术革命浪潮席卷全世界,吹遍了每一个角落,也给古老的蚕业带来了欣欣向荣的景象。这里我要提的是近年来PCR、RFLP、RAPD技术的兴起给蚕丝业带来的活力和转基因的成组。
  PCR(Polymerase chain reaction)技术是1985年由美国人MUllis创建。90年代在我国得到应用的一种体外酶促DNA扩增方法.成功点是始于Chien等从嗜热性水生菌中分离得到的一种热稳定多聚酶,即TaqDNA聚合酶。BCR因灵敏性高、操作简便、快速高效而备受人们青睐。经过10年多的发展又出现了倒转PCR、逆转录PCR、不对称PCR、重组 RNA PCR、复合PCR、半定量PCR、标志 PCR、二段扩增PCR、竞争性PCR等。其技术已渗透于医学、分子生物学、生物工程、性别鉴定、环境监测、考古学等诸多领域;RFLP(Restriction Fragment Length klymorPhism)是 80年代中期兴起的一种新技术。1980年 Botstein首先提出利用 RELP作为标志构建遗传图谱。直到1987年Donis. Keller等人才构建出第一张人的RELP图谱。其原理是物种由于长期进化的结果,使得物种间甚至品种间在同源染色体的DNA序列都产生很大差异。在限制性内切酶的作用下,产生相当多的大小不等的DNA片段,用放射性同位素标志的DNA作探针,将其相关的片断检测出来,从而构建出多态性图谱。这种技术在动物育种中其价值是不可忽视的。
  这是因为RFLP来源染色体DNA的自然变异,数量是巨大的,可抽取足够数量已标志的RFLP片段把所有数量性状包括在内。其次,RFLP标志的DNA本身不象形态标志或同工酶标志那样受生物发育阶段或生物生活环境的影响。而且与基因的显隐性无关,可以看成是遵循盂德尔遗传规律的一种“并显”性状:F1是双亲的RFLP,而F2又自由分离,且RFLP之间或RFLP与表型之间都存在过连锁关系;RAPD(Random Amplified POlymor phism DNA)技术是1990年Williams等人发展起来的一种新型遗传标志.它是建立在PCR技术基础上,利用随机的脱氧核苷酸序列作引物(通常9—10dp)。对研究的基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶或聚丙稀酞胶电泳分离,经染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性。它毋需设计已知序列引物。就单一引物而言,其检测基因组DNA多态性的区域有限,但用一系列引物则可以扩大到整个基因组。因此,可以构建基因组指纹图谱(PingerPrint)、品种鉴定、物种亲缘关系以及系统进化等方面的研究。
  正因为PCR、RFLP、RAPD技术的兴起,可以说对农业科研带来了革命性的变化。自从人的RFLP图谱构建后,短短的几年时间就构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻、马铃薯、蕃茄等多种生物的RFLP图谱。
  1991年 Rhode Island大学的M.R. Goldsmith首先提出国际蚕分子育种计划 (International Silkwrm Project),这一计划是由“人类基因组计划”而萌发的。虽然不能和“阿波罗登月计划”相媲美,但也可算是突破“零敲碎打”,实现家蚕育种革命性的飞跃。这一计划主要是制作蚕的分子基因图(Mdecdar Gene Map)以及数量性状定位分 析(Analysis of Quantlftatlne Traits Locus 简称QTL作图)。经三年的努力已筛选出60个蚕的DNA标志。代表了蚕的全部28个连锁群中的24个。日本的安河内佑,河本夏雄利用 RFLP和RAPD技术已构建了家蚕高密度连锁图。国内西南农业大学蚕桑丝绸学院重点实验室已完成了家蚕分子基因图构建的前期准备工作。1994年从家蚕后部丝腺中抽取了基因组DNA,构建了家蚕DNA全文库,又用已克隆的丝腺蛋白H链基因(Pfb100)和丝胶基因(Psr100)为探针,采用 DNA RFLP分析技术,确定了DNA/PSt-Fb适于做DNA分子标志。利用Pfb2.9探针,对茸毛形状不同的几个品种DNA进行RFLP分析, 观测到丰富的多态性,利用60个随机引物对黄血易位限性系统进行RAPD分析,初步确认了引物OPG-03扩增带有一条与黄血形状紧密连锁。用120个随机引物对NI’(无半月纹)进行RAPD分析,找到了引物,OPA-08扩增带有一条与NI’紧密连锁。此外,通过对59个家蚕不同地理品种及野蚕之间的遗传变异性进行了研究。结果表明;中国一化四眠是最早从野蚕中分化出来的,而中一化三眠、中二化、日本种、欧洲种、热带多化为独立的一类。
  通过对12个桑树种,2个变种的RAPD分析,推测川桑为最早分化的桑种. 日本学者小林淳等开发了用PCR技术对象蚕核型多角体病毒病作早期诊断.从蚕儿食下多角体两天后。从蚕体液、粪中可扩增出特异片段;内田客手等采用PCR技术建立孢子虫早期诊断。国内陈秀等也采用PCR技术诊断家蚕微孢子虫,取得明显的效果.
  将外源基因导人家蚕宿主并进行表达这是实现蚕丝业技术革命的关键。近年来,在蚕 的转座因子的研究方面也有很多突破。1986 年,Kfators小组首先发现了家蚕卵壳蛋白基 因BmA、LⅡ很象果蝇中发现的反转录病毒类的转移因子。其后研究者又发现了Bmla因子(类Copia因子)、核糖体DNA插入因子、 Bml因子、KI,4因子。1989年苏联学者尼古拉耶夫等开展了重组DNA,通过显微注射导入家蚕受精卵内,使外源DNA得到了表达.1991年,田村将家蚕丝心蛋白H链基因的启动子和CAT报告基因,SV40的polyA信号肽序列与PBR322质粒拼接成一个PFbCAT嵌合基因,通过显微注射的方法转移到蚕受精卵内,首次建立了家蚕幼胚瞬时的表达系统。1979年,陈元霖将具有普斑、黑镐、虎斑性状的DNA注入素蚕,获得变异普斑蚕.1986年,李振刚进行了家蚕茧色(PK.K基因)、卵色基因、斑纹基因的转移研究,结果在受体后代中分别获得了目的基因表达的个体.1990年,B.Bello和P.Couble进行了丝心蛋白P25基因转移到果蝇唾腺中的表达研究,也取得了一定的成功。
  利用BmNPV作载体在家蚕体内表达外源基因,这是日本学者前田一项具有开创性的工作,他把蚕的应用引入到一个新的领域.自从1984年BmNPV载体表达系统建立以来,已有20余种外源基因,如乙型肝炎表面抗原、人的a·-干扰素、白细胞介素、类胰岛素样生长因子等获得了表达。日本最近又报道,以Haime Mori为首的研究人员将萤火虫的荧光素酶基因导入目宿银纹夜蛾核多用体病毒(AcNPV)中,置于Drosophila热激蛋白基因启动于调控下,将重组病毒接种于幼虫,在后代能检测到荧光素酶活性。PCR扩增和soutnern印迹分析荧光素酶基因至少传递两代。1997年张峰、陈秀、黄君霆等报道利用家委细胞质肌动蛋白基因(A3)启动子和NPV病毒即刻早期蛋白IE启动子在家蚕细胞中表达绿色荧光蛋白,取得了较好的效果。
  3 扬起生物学的风帆加速蚕分子育种的步伐.  
  家蚕杂交育种其数量性状是依据表现型进行选择的。但表现型易受环境影响,因而难以在早代作出准确的判断。利用遗传标志对目标性状进行选择可以大大提高育种效率。
近年来,分子标志的出现以及分子图谱的建立,分子标志辅助育种手段才逐渐受到育种家们的关注。例如,在常规的育种中,回交是把获得的具有目的性状的后代再与其亲本杂交,以恢复亲本原有的优良基因型。从遗传统计学角度说,回交20次才可选到与目的基因连锁的供染色体片段约10个遗传学图距单位(相当于100个基因),而使用RFLP图谱可直接选择到那些在目的基因附近发生重组的个体,在150个回交F1个体中,至少有一个在目的基因左或右侧1个遗传学图距单位内发生一次交换的概率为95%,而在F2的300个回交个体中,至少有一个在目的基因的另一侧l个遗传学图距范围内发生重组的概率也为95%,这样,只需两代便可获得与目的基因连锁的供染色体片段在2个遗传学图距单位的个体。这在常规的育种中需回交100代才能达到相关的效果。
  家蚕育种目前正处在一个传统的育种方法和近代生物技术育种向分子育种迈进的十字路口。我国蚕资源丰富,克隆基因得天独厚。因此,加速国内外共同合作,建立家蚕分子图谱,以使全人类共同分享。自从Goid.Smith提出“蚕分子育种计划”,使一度彷煌的蚕育种研究出现了“柳暗花明又一村”的新局面。现在完全可以相信:随着家蚕分子图谱的建立以及转基因技术的完善,育种家们完全可以象儿童搭积木一样,随心所欲地组合各种家蚕新品种。过去认为是“天方夜谭”的时代已即将消失了,生物技术的阳光将真正光沐蚕丝业。 


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