候成香1 李木旺1 高峰林2 袁松3
(l中国农业科学院蚕业研究所 江苏镇江 212018)
(2安徽省金寨县蚕桑办) (3合肥市桑蚕原种场)
蚕与其生活的环境是一个统一的整体,当外来因素妨碍了家蚕的正常生长发育时,就有可能引起蚕病。这些外来因素有:病原微生物的感染,害虫的侵袭,理化因素的刺激以及营养不良,饲育技术措施不当等。蚕病是为害蚕业生产的主要因素,从事养蚕的单位或多或少地被其为害,尤其微粒子病给部分蚕种场带来了很大的损失。
蚕病可分为传染型蚕病和非传染型蚕病两类,传染型蚕病对蚕业生产的为害要比非传染型蚕病严重,主要包括真菌病、细菌病、病毒病、微粒子病等。非传染型蚕病主要有节肢动物侵害、中毒症和生理障害等。当传染型蚕病发展到肉眼可见病症时,一般来说损失是比较大的。蚕病的防治主要采取以“防”为主,“防”、“治”结合的综合防治措施。“防”的措施主要有严格消毒防病,杜绝传染;加强饲养管理,增强蚕儿体质等;“治”则必须及时发现蚕病的征兆,进行准确的诊断,查明发病原因,把蚕病消灭于萌芽状态。蚕病的准确诊断是治病的基础,只有快速无误地判断出是哪一种蚕病,才能及时采取有效的措施(如病毒病淘汰发病蚕后采取
撒新鲜石灰粉;而僵病则采取撒防僵粉及熏烟等措施)。目前,蚕病的检测方法主要有:肉眼鉴别,显微镜观察,血清学诊断和PCR法诊断等。
1 肉眼鉴别
蚕病的症状因蚕病的种类不同而不同。观察蚕的群体发育、蚕的行动、体形、体色、病斑、体壁弹性、吐液、排粪以及脉搏等外观症状,抓住不同蚕病的特异性病症和病变,初步判断出是哪一种蚕病。如血液型
脓病的典型症状是行动狂燥、体壁易破、体液乳白;中肠型脓病的典型症状是蚕体弱小,排出白色粘粪,中肠后部呈乳白色病变;但病的主要病症是体表出现许多斑点,初死尸体柔软,不久尸体变硬,根据最后长的菌丝颜色的不同即可判断是哪一类
僵病;微粒子病的典型症状为丝腺上有乳白色脓疮状小点;急性中毒症的特点是发病突然,吐胃液,表现出乱爬、吐液、痉挛及麻痹等症状,蝇蛆病的主要症状是在寄生部位形成黑褐色喇叭状病班,等等。一般来说,肉眼观察病症尚不能确诊,还必须利用显微镜镜检等其它的方法对病原进行确诊,相互验证。
2 显微镜观察
自从法国的巴斯德(Pasteur L.)利用显微镜发现微粒子病的病原是微粒子原虫以来,显微镜在检查家蚕病原上起到非常重要的作用。要经肉眼初步鉴别以后,利用显微镜检查特定的组织(或体液、消化波),将病原放大一定的倍数(一般40O~600倍),然后观察病原的形态特征,必要时经一定的药剂或染色处理,从而判定是由哪一类病原感染所
引起的蚕病。
血液型脓病取蚕血液检查是否有多角体;中肠型脓病取中肠后部组织检查多角体存在与否;僵病取体液观察是否存在短菌丝及营养菌丝;细菌病镜检消化液看是否有大量细菌存在;微粒子病则是观察组织中是否有微粒子
孢子的存在等等。在镜检过程中,为了防止误检,有时需进行一定的处理,如微粒子与其类似的真菌孢子的区别可采用加入30%的盐酸或硝酸处理,27°C下放置10分钟,微粒子
孢子变形消失,真菌孢子形状不变。对于病毒性软化病和脓核病来说,需采取染色后观察。将中肠壁在载玻片上压成麋状,制成涂片标本,用卡诺氏固定液固定约1分钟,用水轻洗后,用焦宁一甲基绿染色5—10分钟,水洗去多余染料后,在400-600倍显微镜下镜检,如在圆筒形细胞中央有紫红色的细胞核,靠近核的细胞质处有被焦宁染成桃红色的A型球体以及单独存在的B型球状体,则可能为病毒性软化病,
脓核病蚕的圆筒细胞核比正常蚕的细胞核显著膨大且染色性显著降低。但这二种病毒病还需进一步做感染试验才能确诊或直接进行血清学诊断。
3 血清学诊断
3.1 抗血清的制备方法
选用健康成年家兔,体重2.5公斤左右,每周注射抗原(经纯化的病原)一次,一般注射3次,抗原量由少到多(如CPV可分别为160Ug,235fig,309Ug)。可采取肌肉注射、
皮下注射或静脉注射的方法。全部注射完毕后,从耳静脉(或动脉)采血少量,离心后取血清,测其抗体效价,若效价在1000以上,则从心脏取全血,否则追加一次病毒。
3.2 应用血清学方法对蚕病的早期诊断
由于抗体只能与引起它产生的相应抗原发生免疫反应,且具有高度的特异性,因此抗原一抗体反应在蚕业上被应用于蚕病的早期诊断、不同来源病原间的血清学关系等方面的研究。蚕业学者们利用该反应的特异性,已经成功地应用多种血清学方法包括双向免疫扩散法、对流免疫电泳法、酶联对流免疫电泳法、酶标组化法、可溶性酶一抗酶法、斑点免疫结合测定法、生物素一亲和
素系统检测法、胶乳凝集试验法和免疫金银染色法等进行了家蚕核型多角体病毒病(又称血液型脓病BmNPV)、家蚕质型多角体病毒病(又叫蚕中肠型脓病BmCPV)、家蚕病毒性软化病(BmFV)、家蚕
脓核病(BmDNV)以及家蚕微粒子病(Nosema bombycisN. b)的早期诊断,与常规的显微镜检测和肉眼检测相比,均能在感染初期检出。由于抗原一抗体间反应的特异性,利用血清学方法进行蚕病的检测不会发生误检的现象,尤其是病毒性软化病和
脓核病用肉眼鉴别及显微镜镜检的方法不易确诊,应用该方法能够快速、准确地判定是由哪一类病原感染所引起。
3.3 家蚕病原的血清学分类
由于病原的亚类之间用常规的方法很难区别,利用抗原一抗体之间的特异性反应,完全可以将它们区分开。渡部等(1986)根据伊那株、山梨株和佐久珠等脓核病病毒的血清学关系,将伊那株BmDNY称为BmDNY-l型,而把佐久株和山梨株合并称为BmDNV-2型。钱
元俊等(1985)发现中国(镇江)株(BmDNV-Z)类似于佐久株DNV而不同于伊那株DNV。佐藤等(1981)应用血清学方法发现 8种微抱子中的 4种(NO. 402,NO.408,NO.520,NO.611)血清学关系同,而其余3种(Mll,M12、M27)只能与各自自身的抗血清发生凝集反应。郭锡杰等(1994)应用玻片凝集法和酶标抗体法研究认为安徽绩溪和江苏东台收集的微抱子和中国农科院蚕研所保存的家蚕微
孢子具有相同的血清学关系,而蓝叶虫微孢子与上述三种孢子间没有血清学关系。
利用抗原一抗体间的反应的特异性和灵敏性,可以在家蚕感病后的较短时间内检出病原,从而能够及时采取措施,减少损失。对于微粒子病来说,利用其可以在很低浓度下检出阳性反应的特点,可以用于补正检查和预知检查,有利于蚕种场对微粒子病的预防,这些优点使得免疫学方法在蚕病学上的应用有着广阔的前景。
4 应用PCR法进行蚕病的诊断
聚合酶链式反应(Polvmerase Chain Reaction PCR)是 K. B. Multis于 1985年发明的一种在体外快速扩增特定DNA序列的方法,它可以在试管中建立反应,经数小时之后,将微量的目的DNA片段扩增至数十万倍,乃至千百万倍,具有快速、敏感、特异、简便等特点。该技术不仅可以用来扩增与分离目的基因,而且在临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的鉴控、基因突变与检测、分子进化研究,以及法医学等诸多领域都有着重要的用途。近几年来,蚕业学者们也已经在利用PCR方法对蚕病的检测作了很多的研究工作。
4.1 PCR法检测的原理
PCR法用于扩增两段已知序列之间的DNA区段。由DNA聚合酶催化的一系列反应,必须使用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下,这两段寡核苷酸引物的序列互不相同,并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补,而这两段模板序列又分别位于待扩增DNA的两侧。反应时,首先在摩尔数大大过量的两段寡核
苷酸及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。随之,将反应混合液冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。此后退火引物在Tau DNA聚合酶的作用下得以延伸。如此反复进行变性和退火及DNA合成这一循环。由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板,所以在这一周而复制的过程中每完成一个循环,就基本上使目的DNA产物增加一倍。
应用PCR检测的方法,就是在已知病原的核酸组成的基础上,人工合成寡核苷酸引物,该引物必须与该病原DNA的特有序列的两端配对。然后应用PCR法进行扩增,如果能获得阳性条带,证明反应体系中含有该病原核酸,从而说明目的检测对象是已感染该病的蚕(或蚕种、蚕蛹、蚕蛾)。
4.2 应用PCR法进行蚕病的早期诊断
阿部广明等(1993)应用PCR法进行了家蚕脓核病的早期诊断,接种DNV-l或DNV-2后,在不杀死蚕的情况下,在蚕粪中成功地检测到DNV病毒,并运用PCR法比较了对DNV感病和抗病的品种在添食DNV后不同时间内蚕粪中病毒检出的差异,发现抗病品种仅在添食后1天内的蚕粪中能检测到DNV病毒,在第二天以后不再检测到,而感病品种在蚕粪中一直能够检测到病毒,直到病蚕死去。野口洋子等(1994)采用PCR技术在蚕粪中检测血液型脓病的病毒,在二龄后期混入感染了NPV的病蚕,并对混入后病蚕的群体蚕粪进行PCR法检测,能够在20,000头中混入1头的情况下成功检出,并于1995年进行了简化改良。陈秀等(1996)以家蚕微孢子虫及其感染蚕DNA、采集自桑尺蠖的微孢子虫孢子DNA为模板,利用合成的两对引物进行扩增,成功地进行了家蚕微粒子病的早期检测,其中引物Ⅰ的扩增产物为家蚕微粒子的特异的DNA序列,可区分出非家蚕微粒子的其它微
孢子感染蚕,而引物Ⅱ可作为一般微孢子虫类的特异引物,通过PCR扩增检测出微孢子虫类(不一定是家蚕微粒子)感染蚕。蔡平钟等(1997)应用N.b(日本株)直接测序的基因组DNA序列设计引物,对我国主要蚕区的家蚕微孢子虫进行了特异性扩增,初步建立了N b PCR诊断技术。
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