分子标记与家蚕遗传育种


           裘智勇 叶夏裕 赵巧玲 夏定国
           (中国农科院蚕业研究所 江苏镇江 212018)

  当前,家蚕遗传育种中所采用的常规育种法主要以形态性状、细胞学及生理生化标记等作为遗传标记来进行选育的。众所周知,常规育种法很费时费力,而且其杂交育种时所依据的表现型性状如体质、茧丝质、产卵量等,易受环境影响,很难在早期作出准确的判断。自Botstein等(1980)首次提出用DNA限制性片段长度多态性(Restriction FragmentLength Polymorphism,简称RFLP)作标记来构建遗传连锁图谱的设想[1]以来,分子标记技术发展迅猛,日益成为基因的遗传操作和动植物遗传育种的重要工具,并已广泛应用于多种生物遗传连锁图谱的构建及重要基因的定位和克隆中。本文将概述几种主要的DNA分子标记技术在家蚕遗传育种中的应用及展望。

  l 分子标记及其研究进展

  1.I RFLP标记
  RFLP标记是利用放射性同位素或某些非同位素标记随机的基因组克隆和cDNA克隆的单拷贝,轻度重复或中度重复序列的探针与转移于支持膜上的经限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点等位性变异(多态性)的一种技术。
  RFLP标记是按孟德尔式共显性标记遗传的,在用RFLP标记定位时,并不需要知道有关性状的任何生化性质,也不必分离特定的基因,只要有单一序列就行。与传统的遗传标记相比,它具有下列优点:(1)无表型效应,RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响;(2)RFLP标记在等位基因之间是共显性的,因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响;(3)在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应,因而互不干扰;(4) RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,在数量上几乎不受限制。这些优点使得RFLP标记特别适合于构建遗传连锁图谱,也广泛应用于家蚕的遗传育种研究。
  COldsmith等采用两个“近交系”蚕品种P50(热带种)和C180(中国种)的原种、F1、F1回交和F2个体蚕为材料,通过RFLP分析,第一次筛选了60个RFLP标记,这些标记分布于蚕的24个连锁群上,在此基础上进行了补充和完善,到1994年为止已初步绘出了策一张家蚕分子连锁图[9,10];鲁成等以已知基因(pFb100和pSr100)为探针对家蚕染色体组DNA进行RFLP分析,结果表明RFLP标记可用作家蚕基因图谱的分子标记[11];鲁成等以丝素基因的结构基因之一部分(pFb2.9)为探针进行RFLP分析,以寻找并建立适于构建分子基因图的RFLP标记,并探讨了pFb2.9RFLPS与茧丝茸毛性状的关系[12]。但由于RFLP标记技术实验流程长,信息量较少而且以放射性同位素为主,加上目前家蚕中可用的RFLP探针数很少且探针制备也很麻烦,而使RFLP技术在家蚕研究中受到一定的限制。
  1.2 RAPD标记
  RAPD标记( Random Amplified Polymorphic DNA,简称RAPD)是在PCR技术基础上发起来的分子标记技术。该技术利用一系列不同的随机引物(常为9-10bp),对所研究的基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物通过电泳分离,经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,从而得出基因组相互区域的DNA多态性。
  与RFLP标记相比,RAPD标记有以下几个特点:(l)合成一套引物可用于不同生物基因组的分析,而不象RFLP标记那样有一定的种属特异性;(2)减少了许多预备性工作如制备克隆、同位素标记、Southern转移、分子杂交等,而且使用的模板DNA量极少;(3)绝大部分RAPD标记是显性标记;(4)能迅速提供重建系统发育史所需要的大量遗传标记;(5)耗费的人力、物力较少。这些优点使得RAPD标记技术得以迅速发展并被广泛应用。
  RAPD技术是家蚕研究中应用最为广泛的一种分子标记技术,该技术已被广泛应用于家蚕重要基因的定位[25.26],遗传连锁图谱的构建,分子标记检测,以及起源与进化[28,29]等领域中。
  1995年,阿部广明等利用W+p易位系支137,在400个随机引物中发现了与性别有关的UBC-218标记,并被确认为W染色体的特有标记[13];夏庆友等利用RAPD标记技术对转座黄血WY系统的Y010、第1无半月纹N01‘系统、伴性赤蚁油蚕Odl。进行了RAPD分析,获得了3个连锁的特异RAPD标记[14],为分子标记辅助育种开辟了广阔的前景。1995年,Promboon.A等采用RAPD标记技术对C108和P50构建的遗传群体进行分析,成功地绘制了家蚕第一张RAPD标记分子连锁图[15],该图谱包含158个RAPD分子标记位点,分布于29个连锁群上;同年,日本的河本夏雄等利用RFLP和RAPD技术构建了家蚕高密度连锁图[16];最近,李斌等以大造、C108及其F2群体构建了1个含182个RAPD标记位点的连锁框架图[17],进一步补充和完善了原有的标记图谱。张春玲等采用RAPD技术对蓖麻蚕DNA导人蚕卵内引起的家蚕变异的新品系基因组进行了RAPD检测,从分子水平上揭示了外源DNA导入受体后引起后代基因组的显著变异[18];刘春宇等用RAPD技术检测了家蚕与蓖麻蚕杂交后代的基因组NDA,结果表明该变异品系存在着明显的“偏母件”与“变异性”[19],把RAPD技术引入远缘杂交研究,为阐明远缘杂交的本质及其遗传机理开创新途径。
  但RAPD标记提供的信息量少、重复性差、稳定性差等,故需将RAPD标记克隆后转变成RFLP标记来应用。
  1.3 AFLP标记
  AFLP标记是扩增片段多态性(Amplified Fragments Length Polymorphism)的简称,它在分析中显示的多态性DNA片段是通过PCR扩增所产生的。由于此法选择性地对DNA片段进行扩增,又可称为SADF(Selective Amplification Fragements)。
  1999年,西南农业大学的何宁佳等对C108和大造进行选择性扩增,随机选用的3个引物均能获得20条以上的稳定的扩增带,在两个品种间得到了11个多态性片段[20]
  AFLP标记技术信息量很大,可产生无数的标记数目,筛选家蚕分子标记的效率高于RFLP标记和RAPD技术。但其操作繁琐,技术要求高,从而使这一技术的广泛应用受到一定的限制,故目前在家蚕研究中鲜有报道。
  1.4 微卫星DNA标记
  微卫星DNA是一类由几个核苷酸(一般为1-5个)为重复单位组成的,其长度一般小于10bp的串联重复序列。同一类的微卫星DNA可分布在整个基因组的不同位置上,由于重复的次数不同以及重复的程度不完全而造成了每个座位的多态性。
     做卫星DNA标记具有以下特点:(1)多位点性,即一个探针可同时检测基因组中数十个位点的变异性;(2)高度变异性;(3)遗传方式简单,遵循孟德尔遗传方式。一般可根据每个微卫星DNA两端相对保守的单拷贝序列设计一对特异的引物,扩增每个位点的微卫星序列,再经凝胶电泳,比较扩增产物的长短变化,即可显示不同基因型个体在每个微卫星DNA位点的多态性。
  微卫星DNA标记现已广泛应用于分子标记连锁图的构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域[21],并有取代RFLP标记而成为第二代分子标记的趋势。至于在家蚕中,微卫星标记开发和利用的研究尚未见报道。这是由于要获得微卫星DNA标记一般需建立、筛选基因组文库和克隆测序等一系列实验,消耗非常大,工作量也很大,从而限制了这方面的研究。但微卫星标记是一种共显性标记,它不仅可简化遗传分析过程,而且有利于不同群体间的标记转换[22],此外,一般只需2个、3个和4个核苷酸为重复单位的微卫星标记就足以构建饱和的分子连锁图谱甚至是STS物理图谱[223,24]。因此,一旦开发出一套微卫星标记,其对蚕业研究发展产生的效益将是无可比拟的,相信不久将来,肯定会有不少研究者着手开发家蚕的微卫星标记。
  除上述几种分子标记外,还有STS、ALP等标记。

  2 分子标记在家蚕遗传育种上的前景展望

  2.l 保证回交中导入有利基因,提高筛选效率
  长期以来,家蚕遗传育种家一般通过用带理想性状的材料(如体质强健或丝质优的品种)作为供体亲本和待改良的品种(轮回亲本)进行杂交,得到的子代再与轮回亲本杂交,然后在后代中选择带目标性状的个体再与轮回亲本杂交可得到想要的品种。但是回交不仅转移了目标基因而且转移与之连锁的不利基因(即连锁累赘),这使得新品种与原来的目标不一致。同时传统的多代回交后的子代的连锁片段带很大,由于缺乏有效的方法去鉴定重组个体。常常只能凭运气偶尔选择到含较少连锁不利基因供体片段的重组个体。如果采用分子标记进行选择可避免或显著减少连锁累赘的程度,还可以运用与目标基因紧密连锁的分子标记对该区域的重组个体进行筛选,这样就有可能通过较少的回交世代而得到所期望的良种。
  2.2 进行数量性状QTLS分析
  家蚕许多重要的经济性状和生理性状大都为数量性状,其变异是呈连续的正态分布,主要是由于微效多基因的累加作用,以及环境的影响,因而不能依照质量性状的处理方法将单个基因的效应区别开来,需采用数理统计的方法把控制某一数量性状的多个基因作为一个整体进行研究。传统的研究方法无法鉴别出单个数最基因或染色体片段,更难确定数最性状基因座位在染色体上的位置及其与其它基因的关系。借助分子标记去追踪每一染色体片段的传递,不但可对QTL所在基因组进行一段一段地分析,而且可直接测量过去所不能鉴别的各染色体区段的效应。在理论上,通过这种方法可绘制出影响数量性状的所有主要基因的详细连锁图即分子标记图谱,借助于这完整的分子连锁图谱可以将复杂的数量性状剖分为由若干离散的孟德尔因子所决定的组分,并进而确定其在染色体上的位置、单个效应及互作效应。
  在家蚕研究中已有一些学者采用分子标记技术对家蚕的数量性状进行了QTL初步分析,如何克荣等确定在家蚕第11染色体上存在一个影响全茧量的基因位点,且该位点带有显性效应[25];谭远德等已将茧丝长和茧层量的主基因分别定位在染色体上的两个性连锁的形态标记基因如赤蚁和油蚕的两侧[26]
  总之,分子标记为把QTL转化为经典育种计划中易于操纵或遗传工程中可以克隆的孟德尔或准孟德尔单位提供了工具,以分子标记及遗传图谱为基础的技术可以帮助育种家定位和操纵与数量性状表达有关的单个基因座位提供了有效的途径。
  2.3 进行质量性状基因的定位
  家蚕的强健性、一些抗逆性等重要的生产性状大多表现为质量性状遗传的特点,用传统的育种方法来选择目标质量性状基因困难很大,利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记是进行质量性状选择的有效途径。定位方法目前有两种:(1)利用近等位基因系进行基因定位。由于近等位基因系其基因组DNA除目标基因所在区域同轮回亲本不同外,其余部分则基本相同,故可利用分子标记如RAPD对这两个基因组(轮回亲本和近等基因系)的DNA进行多态性检验,找出这两个基因组扩增产物的差异,以这些差异物为标记,通过RFLP分析即可定位此基因。
  最近,贺一源等对家蚕抗脓核病近等位基因系进行了RAPD分析,初步探讨了与抗脓核病基因连锁的分子标记[27]。(2)利用对目标基因有分离的F2群体进行基因定位,根据F2代个体中目标基因的分离构建DNA文库,通过RAPD等分子标记技术找出同目标区域相连的DNA多态性标记,进而定位该有明显标志性状的基因。
  2.4 研究家蚕的起源与进化及分类
  有关家蚕的起源和进化,日本的吉武利用同功酶分析研究而提出中国一化性品种为其它各地理品种的起源中心,化性是从一化向多化方向演化的;而我国的蒋猷龙则根据考古学和气象资料进行研究,提出了家蚕起源多中心学说。家蚕的起源和进化究竟如何,至今尚无定论。我们可通过分子标记技术(如RAPD)建立家蚕基因组指纹图谱,进而可以对不同地理品种的家蚕、野蚕等进行正确分类。如华卫建等用RAPD技术检测了家蚕四大地理系统的9个品种的DNA多态性,发现OPX-14等 5个随机引物可用以区分这9个品种。通过对扩增带型差异作遗传距离分析和聚类分析,结果能准确反映四大地理系统之间的遗传差异[28];翁宏飚等运用RAPD技术对9个家蚕不同地理品种、野蚕及桑尺蠖之间的遗传差异性进行了研究。结果表明:RAPD标记能反映各基因组之间丰富的多态性,聚类分析所得的各供试品种材料间的亲缘关系和常规遗传分析的结论相一致,是家蚕分类学研究的一种方法[29]
  此外,分子标记还可以进行家蚕品种的鉴定;进行杂交优势预测,筛选出优良的杂交组合;同时也可能加速从野蚕等同属品系中获取重要的基因的进程。通过检测紧密连锁的分子标记,开展分子标记辅助筛选,将有助于育成综合许多优良性状的蚕品种。
  分子标记的寻找和确定是分子图谱构建和最终实现分子标记育种的最重要和最基础的工作。虽然到目前为止,在家蚕方面所发现的质量目标性状标记与数量性状标记都很少,家蚕分子标记育种方面的工作也尚处于探索阶段。但家蚕是遗传研究最为详尽的生物之一。自田中发现第1个连锁群以来,已发现28个连锁群,定位基因217个,记录基因已逾400个,为分子基因图谱的构建奠定了基础。Goldsmith[30]等提出的“国际蚕分子育种计划”以及国内向仲怀等[31]提出的“家蚕分子基因图谱构建计划”已揭开了家蚕分子育种的序幕。可以相信,随着生物技术进一步发展,随着越来越多的与育种目标性状紧密连锁的分子标记的发现、定位及其高密度饱和的蚕分子连锁图的建立,高效率的分子标记育种时代必将会到来。届时,它必将对我国蚕业发展产生巨大的推动作用。
  
                 主要参考文献

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  7.分子数量遗传学,1994,徐云碧,朱立煌,科学技术出版社
  8.家蚕遗传育种学,1981,中国农业科学院蚕业研究所,科学技术出版社
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