从桑树营养组织中提取高纯DNA的方法


              赵卫国   潘一乐
          (中国农业科学院蚕业研究所 江苏镇江 2120l8)

摘 要 本文通过改进SDS和CTAB提取DNA的方法,对不同的桑树材料进行了DNA的提取。结果表明2种方法都获得了高质量的DNA,并进一步指出CTAB法特别适合高糖、酚类化合物高以及样品氧化程度高的材料。

  随着分子生物学的发展,产生了许多直接在DNA水平上进行遗传分析的分子生物学实验方法,加限制性酶切片段长度多态性(RFLP),随机扩增多态性DNA(RAPD),串联重复序列(SSR),扩增酶切片段长度多态性(AFLP)等,这些方法已广泛用于生物学研究的各个领域,在这些技术的实验过程中,DNA质量是影响实验的关键因素之一,由于桑树组织所含复杂次生化合物的影响,从桑树组织中提取高纯度DNA相对比较困难,目前已发表多种从植物组织中提取DNA的方法[1 2 3],但针对桑树简便经济的高纯度DNA提取方法仍需要进一步探素和改进。
  已报道的提取DNA方法,实验要求和实验成本较高,而且桑树的树脂和酚类化合物含量,很难获得高质量的DNA,从而影响了实验结果。笔者以桑树组织培养幼苗、芽、秋叶为提取材料,分别采用SDS和CTAB法进行DNA的提取,结果获得了高得率、高纯度的DNA。在实验过程中,对SDS和CTAB法的提取程序也进行了改进,大大简化了实验步骤,提高了实验效率。

  l 实验材料和方法

  1·1 实验材料
  实验材料为插桑的叶片、芽以及丰驰桑组培苗。
  1·2 DNA的实验方法
  以下介绍的2种提取方法分别根据COuch[4]和Murray「5」等的方法改进而来。
  1.2.1 CTAB方法:
  在5ml离心管加入2mlCTAB提取液[(100mmol/L Tris(pH8. 0),20mmol/LEDTA( Ph8. 0), 1.4mmol/L Nacl, 1%CTAB,5%PVP,350mmol/L β-mercaptoet hanol)]在水浴锅中(65℃)预热;取2—3片嫩叶剪碎置于研钵中,加液氮速冻,充分研磨后移到上述离心管中;在65℃下保温30min,并不时摇动;取出离心管置于冰浴中冷却至室温;向离心管中加氯仿2ml,摇匀离心10min(1000r.m-1,取上清液至另一已编号的5ml离心管中,加入2V无水乙醇沉淀DNA,在-20℃下冷却2h;高速离心10min(1000r.m-1),充上清液,倒置干燥后加500ul纯净水溶解;离心10min(1000r.m-1,取上清液至一已编号的1.5ml离心管中;加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提2次,氯仿:异戊醇(24:l)抽提2次;加2V无水乙醇沉淀DNA,过夜;离心10min后用70%无水乙醇漂洗;倒置干燥后加入10OulTE溶解,-20℃下保存备用。
  1.2.2  SDS方法:
  在5ml离心管中加入1.5ml SDS提取液[100mmol/L Tris (pH8.3),5mmol/L EDTA(pH8.3),5mmol/L Nacl, l.5%SDS,350mmol/L β—mercaptoethanol]在水浴锅中(65℃)预热;取2-3片嫩叶剪碎置于研钵中,加液氮速冻,研磨后移到上述离心管中;在65℃下保温30min,并不时摇动;取出离心管置于冰浴中冷却至室温,加入500ul 5mol/KAc,充分摇匀,冰浴30min;向离心管中加氯仿2ml,摇匀;离心10min(10000r.m-1,取上清液至另一已编号的5ml离心管中;加入2V无水乙醇沉淀DNA,在一20℃下冷却2h;勾起沉淀物,转入1.5ml离心管中,倒置干燥后加500ul纯净水溶解;离心10min(10000r.m-1,取上清液至一已编号的1.5ml离心管中;加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提2次,氯仿:异戊醇(24:l)抽提2次;加2V无水乙醇沉淀DNA,过夜;离心10min后用70%无水乙醇漂洗;倒置干燥后加入100ulTE溶解,-20℃下保存备用。

  2 实验结果

  以桑树叶片、芽以及组培苗为材料,利用以上2种程序进行DNA提取,DNA的得率和纯度均较高,根据凝胶比色法测定的DNA浓度见图1,A260/A280的比值在1.7-l.8之间。从图中可见:DNA纯度组培苗>芽>叶片;以SDS法提取叶片DNA因叶片老化,提取DNA成褐色,而以CTAB法提取DNA没有出现这种现象,说明CTAB法能有效除去多糖、色素、多酚类化合物,该法对老化叶片及含糖较高的材料可优先采用。对提取的DNA样品我们进行了PCR反应,获得了清晰稳定的图谱,说明提取DNA完全可用于PCR分析。


  3 讨论

  3.l 本提取液中加入适量的PVP和β-mercaptoethanol可避免酚类化合物的氧化,防止褐变现象的发生,特别是提高β-mercaptoethanol的含量(一般为 5-50mmol/L)。
  3.2 2种程序可用于不同材料DNA提取,并可以根据实验需要对该法进行适当调整。
  3.3 本法省略了Rnase以及蛋白酶K的处理过程,因此该法不乏为一种简便、快速、经济的DNA提取方法。

                  参考文献
  1.赵学峰等,桑叶中DNA的含量及桑品种间的差异。蚕业科学,1984,10(3):182-1832
  2. 町井.桑叶全DNA的分离.日蚕杂,1989,58(4):349—183
  3.向仲怀等.采用随机扩增多态性DNA技术(PAPD)在桑属植物系统学研究的应用初报.蚕业科学,1995,21(4):203-208
  4.COUCh J A et al。 Isolation Of DNA from plant highpolyphenolic.Plant MOle Cular BiOlOgy Reporter 1990 8:8-12
  5 Murry H G et al。 Rapid isolation of high molecular Weight DNA。NlCleiC ACidS Resarch,8:4321-4325